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Etude Expérimentale

Evaluation des changements musculaires suite à  des injections intra musculaires de ENDOPEEL

Les auteurs ont étudié l'altération de la marche et les modifications tissulaires au niveau du  muscle suite  à une injection d'endopeel.
Nous avons choisi d'appliquer endopeel dans le muscle pré tibial de rats et d'étudier les altérations histologiques.
Le choix du muscle pré tibial des rats a été fait en raison de la similarité comme masse et forme avec le muscle dépresseur de l angle de la lèvre inférieure chez l'homme

Objectif :  Étudier le phénomène biologique provoqué par l'injection d'endopeel dans le muscle pré tibial du Wister Rat et évaluer les altérations de sa démarche et l'altération histopathologique du muscle injecté.

who are they

Auteurs

  1. Auteurs Principaux et Inventeurs :  
    -Dr.Alain Tenenbaum
    -Sr.Mauro Tiziani
  2. Autres auteurs
    -Dr.Tomas Yung Joon Kim
    -Dr.Romulo Mené
    Pour en savoir plus sur les Inventeurs

    01

    Groupe
    d étude

    Experimentateurs : R.Mené,M.Kim,A.Tenenbaum,M.Tiziani

    N= 29 Wistar rats
    Weight mean : 421g

    Origine des animaux : Biotério Central of Campus of Ribeirão Preto of São Paulo University
    Maintenance : Experimental Pathology Lab of Pathology Department on Medicine School of Ribeirão Preto – USP
    Conservation des Animaux  : boites de polypropylène
    Nourriture des Animaux : diète basique du laboratoire et eau
    Conditions d éclairage : éclairage naturel/cycles d obscurité sous controle d indications basiques.
    Experimentateurs : A.Tenenbaum,R.Mené,M.Kim,M.Tiziani

    pathology department

    02

    Sacrifice des Animaux & Echantillons histologiques

    Microscopie Conventionnelle

    Les souris ont été euthanasiées dans des chambres à CO2.

    • Incision de la peau avec une lame nº 23
    • Recherche  chirurgicale et Isolation du muscle prétibial utilisant les ciseaux de Metzenbaum
    • Section des tendons au moyen des ciseaux de Mayo .
    • Fixation des Portions de muscles sur des sections de chêne-liège.
    • Enrobage Intégration à l aide d une solution de formaldéhyde 50%  - 10% tamponée et 50% de pure paraffine pour l étude en microscopie optique conventionnelle. 
    • Sections de coloration comme processus histologique de routine.
    • Microtome utilisé : Leika RM 2155
    • Coloration des tranches de muscle avec de l

    -hematoxiline-eosine
    -coloration trichromede Masson
    -et red picro-sirius.

    • Histologic examination was realized with a conventional microscope (Olympus BH2)
    • Observation under polarized lampe
    • Photographic documentation was realized with a Leika DMR microscope joined to a digital camera Leika CD 300F and compatible PC.
    microtome

    03

    Matériel

    6 rats/boite
    • Les animaux ont été répartis dans 6 boites, avec 5 rats pour les boites 1,2,3,4,5 et 4 rats pour la boite nr 6.
    • Tous les animaux ont été soumis à une évaluation de la marche en analysant les empreintes des pattes sur un papier spécial ,et i après immersion préalable des pattes arrière dans une solution savonneuse.
    • La boite Nr 1  est destinée au  groupe de controle, et les rats ont recu ici une injection de 0,1 ml de solution saline( NaCl 0,9%) dans le muscle prétibial droit..

    • Les rats des boites 2 à 5 ont recu chacun une injection de 0,1 ml de Endopeel Original au niveau du meme muscle que pour le groupe de controle.

    • La boite Nr 6 contenait 4 rats, et là à chaque rat fu injecté  0,5 ml de Endopeel original dans le tissu sous cutané cette fois  ( non plus en intra musculaire)

    • Tous les animaux furent soumis à un test d évaluation de la marche , avant et après injections.

    boxes for rats

    04

    Méthodes

    Les animaux furent sacrifiés au bout de 10 jours-1 mois- 3 mois-7 mois
    sacrifice table

    Evaluation de la Marche

    Pour enregistrer les empreintes ( des pattes) des rats, des bandes de papier mesurant 43 cm de long sur 8,7 de large, tailles considérées comme adéquates pour la "passerelle" des rats et construites selon le dessin de De MEDINACELI ; LIBÉRÉ; WYATT (1982) . Le papier préalablement trempé dans une solution de bleu de bromophénol a été utilisé.

    Pour la préparation du papier, le bleu de bromophénol sous sa forme anhydride (Sigma) a été dilué à 1 % dans de l'acétone absolu, acquérant une couleur orange.

    Les feuilles de papier étaient trempées dans cette solution et mises au soleil pour sécher, puis elles étaient coupées en bandes et stockées dans des emballages en plastique, afin d'éviter l'humidité, qui pouvait altérer la couleur bleue

    gait evaluation

    The animals were made to walk on the catwalk covered with the previously prepared paper strips, with their hind legs soaked in a solution of neutral detergent, which immediately changes the color of  the footprint from yellow to blue . The footprints remain on the paper strips, which were left to dry for the reading of the necessary measures to calculate the Sciatic Functional Index .
    Later these were analyzed by a computer program (software) developed by SELLI (1998) , to obtain the Sciatic Functional Index that was proposed by BAIN; MACKINNON; HUNTER (1989), which takes into account the print length, the total toe spread between the 1st to the 4th toe,  and the intermediate toes which are the 2nd and 3rd.  The footprints of each animal were obtained before the application of endopeel, as a control, and immediately after the endopeel injection, and again, and at periodic intervals, when the animals were sacrificed for the extraction of the anterior tibia muscle  for histological study.

    Les empreintes ont été numérisées avec un scanner et placées dans le programme SELLI, qui permet la capture, l'identification et l'analyse des images, permettant l'application d'autres méthodes d'identification de l'indice fonctionnel sciatique (DE MEDINACELI, FREED & WYATT, 1982 ; DE MEDINACELI, DERENZO & WYATT, 1984 ; CARLTON & GOLDBERG, 1986), ainsi que les index de fonctionnalité du tibia et le nerf péronier (BAIN ; MACKINNON & HUNTER, 1989). Une fois l'empreinte affichée sur le moniteur, ses paramètres sont analysés et mesurés, ce qui nécessite de placer le curseur à cliquer dans la séquence prédéterminée correcte. Le programme calcule et fournit ensuite la valeur de l'indice, qui est également stockée dans l'ordinateur.

    Footprints of the mouse without any injection

    Footprints of the mouse after 0.05 ml injection in the right pre tibial muscle

    Sciatic Functional Index or SFI Calculation & Measurement

    SFI Calculation

    Schematic representation of the measurements realized to calculate the Sciatic Functional Index.

    E: Experimental (operated foot);

    N: Normal (opposite foot);

    TS: Total opening of the toes (1st to 5th);

    IT: Opening of the intermediate toes (2nd to 4th);

    PL: Length of footstep

    Program used to measure the Sciatic Functional Index SFI

    SFI endopeel measurements

    Gait Analysis

    gait analysis

    Gait Conclusions

    • NaCl 0.9%, 0.1 ml into the pretibial muscle does not alter the gait.

    • Endopeel at 0.1 ml intramuscular pretibial affects the gait accentually,  immediately after the application & moderately after 10 to 30 days.

    • The alteration in the gait caused by Endopeel decreases with time when applied via intramuscular, at this level of concentration.

    • Application into the  subcutaneous tissue is not as efficient as intramuscular.
    • When 0.5 ml is applied into the subcutaneous tissue (pretibial muscle region) there is a progressive loss of gait, probably because of the slow diffusion of Endopeel from the subcutaneous tissue  to the intra muscular one.